Autophagy (자가 소화 작용)는 불필요한 세포질 구성물질 (세포 내 단백질 및 세포 내 소기관)을 lysosome을 이용하여 분해하는 작용으로 체계로써 세포 내 영양결핍이 진행되는 동안 세포가 apoptosis로 가기보다는 autophagy를 통해 homeostasis를 유지에 기며, 노화 및 종양 억제, 세포내부 침입 미생물 제거, 그리고 발생(분화) 과정에 관련된 모든 단계에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
Autophagy기능은 효모에서부터 인간까지 진화적으로 잘 보존되어 있으며, 진핵 세포의 생존을 위한 필수적인 기능으로 인식되고 있다. 이러한 autophagy 작용과 관련된 여러가지 생명현상 중에서reactive oxygen species (ROS; 활성산소) 자극에 의한 mouse and human embryonic stem cells(m/hESC)의 방어 기작에 대한 규명 요구가 있어 왔던 바 본 연구는exogenous H₂O₂ 자극 하에서 SIRT1 (NAD-dependent deacetylase; 히스톤 탈아세틸화 효소 (HDAC) class III) 이 autophagy를 직/간접적으로 조절하여 m/hESC의 생존에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구 결과이다.

SIRT1의 주요 기능은 히스톤을 탈아세틸화시켜 chromatin 변형 및 gene silencing에 관여하고 영양결핍에 의한 수명연장의 효과에도 영향을 미치며, 이외에 전사인자들 (FOXO, p⁵³, and NF-kB)을 기질로 탈아세틸화시켜 생존 및 세포 사멸, DNA 손상 반응 및 세포분화과 microRNAs등 세포내 여러 기전에 관여하는 것으로 보고되는 중요 인자이다. 특히 SIRT1은 autophagy-related genes (Atg5, Atg7, Atg8, and FoxO1)을 탈아세틸화 하여 autophagy-lysosome을 조절하는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서는 배아줄기세포에서 autophagy 관련 조절 인자로써 SIRT1의 새로운 기능을 밝혔다.

1. SIRT1 knock-out mESCs는 H₂O₂ 자극에 대해서 Autophagy 저해

먼저, 1mM H₂O₂를 wild type (WT)와 SIRT1 knock-out (KO) 세포에 4시간 동안 처리하여 LC3 (autophagosome marker and mammalian homolog of Atg8; 그림 1a)와 lysosome (그림 1b) 형성을 확인하였다. KO 세포는 perinuclear LC3 dots 와 lysosome 형성이 유의적으로 낮았으며, 3-MA (widely used autophagy inhibitor)처리의해서도 감소 효과를 보였다. 더나아가 autophagy 마지막단계 (the fusion of autophagosomes with lysosome)를 LC3와 LAMP-1 면역염색으로 확인하였으나 (그림 1c), 유의적 차이를 확인하지 못 하였습니다. 이것은H₂O₂에 의한 autophagy 활성이 SIRT1을 통해 일어나지만, down-stream (autophagosome/lysosome fusion)에는 영향을 주지 못한다는 것을 의미한다.

2. SIRT1은H₂O₂ 자극에 의해서 Mitochondrial dynamics를 조절 함.

1mM H₂O₂, 4시간 처리 후 JC-1 염색을 통하여 mitochondrial membrane potential을 FACS 분석으로 측정하였다. KO 세포에서 Mitochondrial depolarization (JC-1 re/green fluorescence intensity ratio)는 유의적 감소를 보였으나, 3-MA 처리군에선 control과 비교하여 변화가 없었다 (그림 2a). 이와 같은 결과는H₂O₂에 의해 발생한 autophagy는 SIRT1을 경유한 mitochondrial membrane potential 저해를 유도하다고 볼 수 있다. 또한 3-MA와 CQ (inhibition of fusion of autophagosome with lysosome)은 WT 세포에서 mitochondrial mass를 유의적으로 증가시키는 반면에 KO세포에서는 변화가 없었다 (그림 2b). 이것은 mitochondria가 제거되는 것이 mitophagy에 의해서 저해된다는 것을 의미한다.

3. H₂O₂는 SIRT1 KO세포에서 autophagy 관련 유전자 (PI3K/Beclin1 and mTOR) 활성을 감소 시킴.

다음 연구 단계로, SIRT1이 직접적으로 autophagy관련유전자의 발현에 어떤 영향을 미치는지에 대해서 살펴보았다. 먼저 LC3는 단백질 합성 후 절단(cleave)되어 LC3-I (cytosol)과 LC3-II (autophagosomal membrane) 에 형성되는데, 보통 LC3-II 발현 확인을 통하여 autophagosome 정도를 평가 한다. 그림 3a/b 에서 알 수 있듯이 H₂O₂ 처리 한 WT 세포에서 LC3-II의 발현이 증가되는 동시에 Beclin-1, cleaved caspase3 그리고 Bax 등이 함께 증가하였다.
반면에 SIRT1 KO 세포에서는H₂O₂ 자극에 의해 유의적 감소을 보였다. 특히 autophagic flux를 조절하는 Bafilomycin A에 의해서 Beclin-1의 감소는 SIRT1이 초기 autophagy 현상에 관여하고 있음을 나타내고 있다. 더욱 흥미로운 연구 결과는 H₂O₂에 의한 유도되는 autophagy가 negative-mTOR pathway에 의해 신호전달되다는 사실이였다. 그림 3c에서 나타나듯이H₂O₂ 처리에 의하여 WT 세포는 p-P70/S6K과 ribosomal p-S6 (mTOR substrates)의 발현이 감소되는 반면 3-MA처리에 의해 발현 증가함을 볼 수 있었다. SIRT1 KO 세포에서는 WT세포와 반대 현상이 관찰되었다. 마우스 배아줄기세포와 마찮가지로 인간 배아줄기세포 (H9)에서도 H₂O₂ 자극에 의해 autophagy 관련 유전자의 비슷한 조절 반응을 보였다 (그림3d/e).

본 연구는 SIRT1은 배아줄기세포에서 oxidative stress 에 대한 (1) PI3K/Beclin1과 mTOR signal pathway를 통하여 (2) autophagy 활성에 필수적 역활을 하며 (3) mitochondria membrane potential를 조절하다는 새로운 연구 결과로써 배아줄기세포가 oxidative stress 하에서 세포 생존을 위하여 SIRT1과 autophagy에 의해 방어 메카니즘이 활성화되고 있음을 보였다. 배아줄기세포는 여러 종류의 신체조직으로 분화 될 수 있는 능력과 자기 재생 능력을 가진 전분화능 세포로써 수술이나 약물요법의 기존 치료법으로 치료가 힘든 수많은 난치성 질환에 대해서 배아줄기세포를 이용한 재생의학적 차원의 새로운 치료법을 제시할 수 있는 무긍한 가능성을 가진 세포이다. 또한 초기 발생 과정 및 질병원인 연구을 밝힐 수 있는 강력한 연구재료가 될 뿐만아니라 각종 신약 개발 및 약물 독성검사에 이용되어 맞춤형 신약을 개발하는데 이용되어 천문학적 규모의 산업으로 발전 가능한 세포이지만, 우리나라 뿐만아니라 선진 각국 연구팀에서 앞다툰 투자와 연구에도 불구하고 배아줄기세포를 이용한 세포치료 및 활용는 현재까지 요원한 상태이다. 이에 본 연구는 세포치료 개발로 가기 위한 기초 연구로써 배아줄기세포의 생존과 stress 방어 기작을 SIRT1과 autophagy 의 연관성 측면에서 새롭게 밝혀 배아줄기세포 활용에 기초 연구 자료를 제공했다는데 그 의의가 있다고하겠다. 특히 SIRT1 활성화 조절이 수명연장으로 이어져 노화뿐만 아니라 종양억제 유전자들과 관련성이 알려지면서 신약개발의 중요한 후보물질로 부각되고 있는 시점에서, 본 연구 결과를 통하여 SIRT1/autophagy의 중요성을 부각하고 치료제로서의 응용 가능성을 제시했다고 볼 수 있다.