유전적 인자에 인한 뇌 발달의 결함은 인간의 정신질환에 있어 중요한 원인중 하나로 생각되고 있습니다. 최근 인간 유전학의 급속한 발전으로 인하여 정신질환의 유전적 원인 인자로 생각되는 single nucleotide polymorphism (SNP)와 조금 더 큰 DNA 영역의 변형인 copy number variation (CNV)들이 많이 알려지고 있습니다.
CNV는 종종 여러 개의 유전자들을 포함하기 때문에 SNP에 의해 연구하기가 상대적으로 까다롭고 작용 기작이 덜 밝혀져 있습니다. 인간 염색체 15번에 위치하는 15q11.2 microdeleton은 4개의 유전자들을 포함하는 CNV로, 정신분열증 (schizophrenia), 뇌전증 (epilepsy), 지적 장애 (intellectual disability)등의 neurodevelopmental disorder들의 원인 인자로 생각되어 왔지만 뇌 발달과정 중에서 이 영역의 역할에 대해서는 잘 알려지지 않았습니다 (그림 1a). 저희 연구그룹에서는 15q11.2 microdeletion을 가지고 있는 환자의 피부세포로부터 유도만능줄기세포 (iPSC)를 만들었고 이를 신경줄기세포로 분화시켜 이 CNV가 신경줄기세포의 특징에 어떠한 변화를 가져오고, 이것이 어떠한 작용기작을 통해 일어나는지 밝혀보고자 하였습니다.

1. Human iPSC line의 확립과 neural rosette에서의 phenotype

우선 15q11.2 microdeletion을 지니고 있는 세명의 환자들의 피부세포로부터 iPSC line을 제작하였습니다. 이 세포주들은 예상했던 것처럼 한 쪽 chromosome에 15q11.2 microdeletion을 지니고 있었습니다 (그림 2a). 이 세포주들을 가지고 인간의 대뇌 발달을 modeling하기 위해서 cortical neural progenitor들로 분화를 유도하여 neural rosette을 생성하였습니다. 이렇게 생성한 neural rosette들은 일시적인 구조이지만, 대뇌 발달상에 neural progenitor들이 지니고 있는 다양한 특징들을 in vitro에서 보여줄 수 있는 model 입니다. 흥미롭게도 15q11.2 microdeletion을 지닌 neural rosette들 은 일반적인 neural rosette들이 지닌 세포 극성 (cell polarization)이 상실되어 있다는 것을 apical polarization marker인 atypical PKC?의 발현을 통해 확인하였습니다 (그림 2b, Y1-1과 Y1-3). 또한, 15q11.2 region에 존재하는 4개의 유전자들 중 하나인 CYFIP1을 발현시킨 세포주들 에게서는 이러한 표현형이 회복되는 것을 통하여 이러한 cell polarization 현상에 CYFIP1 단백질이 중요하다는 사실을 알 수 있었습니다 (그림 2b, Y1-1-CP와 Y1-3-CP).

2. 생쥐 대뇌발달에 있어서 CYFIP1의 역할

환자로부터 유래한 human neural progenitor에서 CYFIP1 단백질이 중요한 역할을 한다는 사실을 알아낸 후, 생쥐의 in vivo 대뇌 발달과정에서 이 단백질의 역할이 무엇인지가 궁금하였습니다. 그래서 Cyfip1에 대한 shRNA를 제작하여 in utero electroporation을 통해 발달하고 있는 생쥐 대뇌에 이를 도입하고 그 표현형을 관찰해보고자 하였습니다. 대뇌 발달 기간 중 신경줄기세포로 작용하는 Radial glial cell들은 안쪽의 ventricular surface에서 N-Cadherin을 발현하는 adherens junction을 서로 형성합니다. 그런데 CYFIP1 단백질이 없는 radial glial cell들은 이러한 adherens junction이 제대로 유지되지 않은 것을 관찰하였습니다 (그림 3a). 또한 adherens junction과 polarity가 상실된 radial glial cell들은 원래 자리하고 있어야 하는 ventricular zone (VZ)보다 바깥쪽으로 위치하게 되어 결과적으로 대뇌 피질 신경세포들의 층 구조 형성 (cortical layer formation)에 영향을 주게 됩니다 (그림 3b). 이러한 결과는 in vivo에서 일어나는 대뇌 발달의 과정중에서 neural stem cell들의 특성 유지가 schizophrenia를 비롯한 neurodevelopmental disorder들의 발병 기작에 있어서 중요할 수 있다는 가능성을 제시해줍니다.

3. CYFIP1에 의해 조절되는 WAVE signaling pathway와 그 중요성

그 다음 궁금증은 CYFIP1에 의해 어떤 signaling pathway에 이상이 생기고, 그것으로 인해 human 과 mouse neaural stem cell의 결함이 생기는지에 대한 것이었습니다. CYFIP1은 actin cytoskeleton을 조절하는 WAVE complex의 한 요소로 알려져 있는데, 15q11.2 microdeletion을 지닌 human neural progenitor에서는 WAVE complex의 요소 중 하나인 WAVE2의 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 확인하였고, mouse neural progenitor에서 CYFIP1 단백질을 shRNA를 통해 감소시켰을때에도 같은 현상이 일어나는 것을 확인하였습니다 (그림 4a). 또한 WAVE complex의 다른 인자인 ABI1이나 그 downstream effector인 ARP2/3를 in utero electroporation을 통한 knockdown 실험을 수행하였을때 CYFIP1을 감소시켰을때와 같은 neural stem cell phenotype들을 확인할 수 있었습니다 (그림 4b). 이러한 결과는 CYFIP1이 WAVE complex를 통해 actin cytoskeleton을 조절함으로써 neural stem cell의 polarity와 adherens junction을 유지하고 있다는 것을 알려줍니다.

4. CYFIP1과 WAVE signaling의 인간 schizophrenia 발병에 있어서의 인간 유전학적 의의

15q11.2 microdeletion을 지니고 있는 유도만능세포주와 그것들을 통해 분화시킨 신경줄기세포들을 가지고 CYFIP1과 WAVE signaling pathway가 신경줄기세포의 성질에 중요한 역할을 하고 있다는 사실을 알아냈습니다. 이러한 사실이 인간의 schizophrenia 발병에 있어 얼마나 큰 의미를 가지고 있는지를 살펴보기 위해, Johns Hopkins University의 Dr. Daniel R. Weinberger 연구진과 공동 연구를 수행하였습니다. 먼저 schizophrenia 환자들의 postmoterm tissue에서 Cyfip1과 WAVE signaling에 관여하는 유전자들에 존재하는 SNP들을 찾아내었고, 이를 기존에 존재하는 schizophrenia 환자들의 유전자 database와 대조하여 이들 SNP들이 schizophrenia 발병의 risk와 얼마나 큰 상관관계가 있는지 확인한 결과, Cyfip1의 SNP와 WAVE signaling downstream인 ACTR2의 SNP가 통계적으로 유의미한 epistatic interaction을 보여주고 있다는 사실을 발견할 수 있었습니다. 특히 Cyfip1의 SNP와 ACTR2의 SNP가 특정한 genotype을 통해 interaction할 때, schizophrenia의 발병 risk가 최대 11배 정도까지 증가한다는 사실을 발견할 수 있었고 이는 이 두 유전자의 결함이 schizophrenia 발병 risk에 매우 중요하게 작용한다는 것을 의미합니다.

무엇보다 이 연구는 iPSC technology를 이용하여 처음으로 multiple gene이 연관되어 있는 CNV genetic risk factor를 modeling하였고, 이를 통해 neurodevelopmental disorder risk의 mechanism을 제시하였다는 것에 그 의의를 둘 수 있습니다.
지금까지의 iPSC를 이용한 disease modeling은 기존의 animal model에서 알려진 사실들을 기반으로 하여 iPSC를 통해 밝혀진 pathway들의 relevance를 확인하는 방식으로 진행되었지만, 이 연구는 기존의 연구와는 다르게 iPSC model을 출발점으로 하여 그 표현형의 정확한 원인유전자를 찾아내고, 이를 다시 animal model에 작용하여 in vivo 표현형을 찾아내는 방식으로 이루어졌습니다. 그리고 이를 통해 특정 signaling pathway를 알아낸 뒤에 이 signaling pathway의 중요성을 human genetic approach를 통해 재확인하는 방식은 앞으로의 연구 방향에 시사하는 바가 있다고 생각합니다 (그림 1b). 이러한 의의들을 인정받아 Cell Stem Cell지에서는 저희의 연구를 featured article로 선정하고 연구 내용을 소개하는 preview를 같이 개재해 주었습니다 (http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(14)00 262-8). 개재 수락이 이루어진 후 human neural rosette 들의 면역 염색 사진을 가지고 firework의 형상을 그려서 보냈는데 cover로 선정되어 저희의 연구 성과를 더 홍보할 수 있는 좋은 기회도 얻었습니다 (http://www.cell.com/cms/attachment/2017550474/203781077 6/cover.tif.jpg)

이번 연구는 Johns Hopkins Medical Institute의 Institute of Cell Engineering에 있는 Dr. Hongjun Song과 Dr. Guo-li Ming 연구팀에 의해 이루어졌습니다. 이 연구를 주도한 윤기준 박사는 포항공과대학교 공영윤 교수님 (현 서울대학교) 실험실에서 유전자조작 생쥐들을 model system으로 신경발생학을 연구하여 박사학위를 취득하였고 현재는 Johns Hopkins University에서 박사후 연구원으로 신경정신질환을 일으키는 발달생물학적 인자들에 대해 유전자조작 생쥐와 iPSC technology를 사용하여 연구하고 있습니다. Institute of Cell Engineering은 Johns Hopkins University에서 Stem cell research에 중점을 두고 집중 투자하기 위해 육성하고 있는 연구소로 윤기준 박사의 mentor인 Dr. Hongjun Song이 Stem Cell Program 의 Director로 연구를 주도하고 있습니다.