Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell, 2016. 19(2): 248-257.

Parkinson's disease (PD)는 중뇌 (midbrain)의 흑질 (substantia nigra pars compacta)에 존재하는 도파민 뉴런 (dopaminergic neuron)이 선택적으로 손실되면서 발생하는 전 세계적으로 두번째로 많은 신경퇴행성 질환입니다. PD는 크게 두가지 요인인 유전적 요인과 환경적 요인에 의해 발병된다고 알려져 있는데, 지금까지 많은 연구가 이뤄졌음에도 불구하고 PD의 발병 메커니즘을 명확하게 이해하지 못하고 있는 실정입니다. 대부분의 연구자들은 PD환자 유래 iPSC를 만들어 2차원적 배양 분화 기술을 통해 도파민 뉴런을 생산, 이 뉴런과 건강한 사람 유래 iPSC를 이용하여 생산한 도파민 뉴런과의 비교 분석 실험을 통하여 질병에 취약한 도파민 뉴런의 차이를 알아내는 질병 모델링을 통해 연구를 진행하였습니다. 혹은 동물모델을 통해서 조직학적, 행동적 표현형을 통해 PD 발병 메커니즘을 이해하는데 노력하였습니다. 그러나 이런 질병 모델은 인간 중뇌 조직과 차이가 있어 실질적인 PD 연구에 한계를 가지고 있습니다. 따라서 최근에는 in vivo에 가까운 in vitro 실험을 구현하기 위해 iPSC의 3차원적 분화 배양을 통해서 인공장기에 가까운 조직, 특 organoid를 만드는 기술이 개발되어 질병모델의 도구로서 유용하게 사용되어지고 있습니다. 본 연구는 2013년도에 Nature에 보고된cerebral organoid생산 관련 논문 (Lancaster et al., Nature, 2013)의 기술을 착안하여 배아줄기세포를 이용해서 midbrain specific organoid를 만든다면 현재까지 in vitro PD모델의 한계를 넘어설 수 있는 유용한 시스템이 될 수 있을 거라는 가정하에 연구를 진행하였습니다.

1) Human pluripotent stem cell에서 생산된 human midbrain-like organoids (hMLOs)는 multi-layered neuroepithelia를 가지고 있으며, floor-plate의 형성을 통해 도파민 뉴런이 분화되어짐을 확인하였습니다.
Figure 1. Generation and characterization of hMLOs from hPSCs. (A) Schematic diagrams illustrating the overall strategy to generate hMLOs. DIC images illustrate the typical morphology of cells at each stage. SBNC: SB431542, Noggin, and CHIR99021; SF: SHH-C25II and FGF8; BGAC: BDNF, GDNF, ascorbic acid, and db-cAMP. Scale bars=500 μm. (B) Left: Cryosection of an hMLO at day35 stained for Ki67 and MAP2. Right: A zoom-in view of the white box. White scale bar = 200μm. Yellow scale bar = 10μm. (C) Quantification of the percentage of Ki67+ and MAP2+ cells at day 25 and 35 hMLOs by FACS analysis. n=3, *p<0.05, Student's t-test. (D) Immunostaining of EdU, OTX2, and aPKC at the apical region of a neuroepithelium (NE). Scale bar = 20μm. (E) Percentages of OTX2+ and OTX+/EdU+ cells at the apical region of NE; mean ± s.e.m., n=7. (F) Schematic of the laminar structure in the hMLOs (bas.: basal; ap.: apical; MZ: mantle zone; IZ: intermediate zone; VZ: ventral zone). (G) Cryosection of a day 35 hMLO stained for MAP2 and MASH1. Scale bar = 50μm. (H) EdU labeling and OTX2 immunostaining of a day 35 hMLO. Scale bar = 20μm. (I) Cryosection of a day 35 hMLO stained for NURR1 and MASH1. Scale bar = 20μm. (J) Cryosection of an hMLO at days 4, 14, and 24 stained for FOXA2 (floor plate progenitors) and OTX2 (midbrain intermediate progenitors). Scale bars = 50μm. (K) Immunostaing of FOXA2 and TH of hMLO at day 45. Scale bars = 50μm. The quantifications are shown in (L); mean ± s.e.m., n=3. (M) Cryosection of a day 45 hMLO labeled for LMX1A and TH. Scale bars = 50μm. The quantification is shown in (N); mean ± s.e.m., n=3. (O) Immunostaining of MZ cells at day 60 with DAT and TH antibodies, zoom-in view to illustrate some cells double positive for DAT and TH. The quantifications are shown in (P); mean ± s.e.m., n=3. Scale bar = 20μm.

2) 3차원 분화 배양을 통해 얻은 hMLOs는 2차원 분화 배양을 통해 얻은 도파민 뉴런보다는 prenatal midbrain과 더 유사한 gene expression profile을 보여줌을 RNA-seq 분석을 통해 확인하였습니다.

Figure 2. Transcriptional characterization of hMLOs. (A) Heatmap showing differentially expressed genes between 2D-DA neurons and hMLOs, sorted by fold change. (B) Heatmap and clustering of expression data from 2D-DA neurons, hMLOs, and prenatal midbrain. The correlation of normalised gene expression using differentially expressed genes between 2D-DA neurons and hMLOs was used to estimate the distance between samples. (C) Venn Diagram indicating the overlap of genes that show up- or downregulation in hMLOs and prenatal midbrain compared to 2D-DA neurons. (significance was estimated using Fisher's exact test). (D) Heatmap showing genes that are differentially expressed between 2D-DA neurons and hMLOs and human prenatal midbrain, sorted by fold change. (E) Example genes expressed in prenatal midbrain and hMLOs, but not in 2D-DA neurons, and (F) example genes commonly expressed in prenatal midbrain, hMLOs, and 2D-DA neurons (Black: normalized read count, blue: split reads that map to two exons. Shown is the average across all samples).

3) hMLOs에서 발견된 neuromelanin을 characterization하였고, L-DOPA 및 Dopamine을 처리하였을때 neuromelanin의 형성이 가속화 되었음을 확인하였습니다. 또한 mouse ESC를 이용하여 만든 MLOs에서는 neuromelanin이 관찰되지 않았습니다.

Figure 3. Identification of neuromelanin in hMLOs. (A) Appearance of dark granules in hMLOs at day 112. Note that dark pigments were localized within the neuronal compartment (arrows) as well as the extracellular compartment (arrowheads). Scale bar = 200μm. (B) Fontana-Masson staining to reveal NM-like granules within an hMLO. Note the presence of NM-like granules in both intra- and extracellular compartments (blue and black arrowheads, respectively). Black scale bars = 100μm. A red scale bar = 20μm. B' is an enlarged view of a region in B. B'' is an enlarged view of a region in B'. (C) Fontana-Masson staining of human postmortem midbrain tissue. Black scale bars = 1mm. A red scale bar = 200μm. C' is an enlarged view of a region in C was from tiling multiple images of a large area. C'' is an enlarged view of a region in C'. (D) NM content measurement in hMLOs (n=3, respectively). (E) SEM image of isolated NM granules in a day 122 hMLO and (F) in human postmortem midbrain tissue. Scale bar = 200nm. (G) The formation of NM-like granules was accelerated by L-DOPA (50μM) and dopamine (50μM) treatments. Red scale bar = 2mm. Black scale bar =100μm. G', G'', and G''' are high-magnification images of the black rectangle. (H) NM-like granules were not observed in murine MLOs. Please note that both the hMLO and mMLOs contain TH-positive mDA neurons (bottom panels). Red scale bar = 2mm. Black scale bar= 500μm. White scale bar= 20μm.

4) Patch-clamp와 HPLC를 통한 기능분석을 통해hMLOs에 있는 도파민 뉴런 특유의 특성을 확인하였습니다.
Figure 4. Functional characterization of dopaminergic neurons from hMLOs. (A) Schematic diagram illustrating the experiment to investigate the electrophysiological activity of hMLOs in situ [recordings (Rec.) and electric stimulation (Stim.)]. (B) Representative traces showing the presence of voltage-dependent Na+ and K+ currents in neurons inside hMLOs. The blue box highlights Na+ channel-dependent inward currents. (C) Averaged current-voltage relationship (I/V) curves for the Na+ and K+ currents recorded (n=12 and 14 for days 33-50 and 65-84, respectively). (D) Representative traces of multiple APs (the lower panel) recorded from neurons inside day 35 hMLOs, evoked by current injection (the upper panel). (E) The number of APs generated in response to a particular current pulse amplitude, of neurons inside hMLOs (n=12 and 14 for days 33-50 and 65-84, respectively). (F) Spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and spontaneous inhibitory postsynaptic currents (sIPSCs) (shown in 1) recorded from a neuron inside hMLO at day 80. These sEPSCs and sIPSCs were blocked by CNQX (an AMPA-type glutamate receptor antagonist) and AP5 (an NMDA-type glutamate receptor antagonist) (shown in 2) and by picrotoxin (PTX, a GABAA blocker) (shown in 3), respectively. (G) Electrical stimulation-evoked synaptic response recorded in the day 50 hMLO. The red dot indicates onset of electrical stimulation. (H and I) Representative trace and frequency of spontaneous APs. (J) Example traces of rebound depolarization. Insets show enlarged view of respective traces. (K) Representative trace of pacemaker-like firing and the effect of Quinpirole on firing frequency, and its statistical analysis (L) (*p=0.021, paired t-test, n=3). (M) TH immunostaining of a neuron filled with biocytin during the recording, indicating that the recorded neuron expressed TH. Scale bar = 5 µm. (N) Dopamine measurement in hMLOs and hCOs by HPLC [hMLO 4w, 5w, 7w, and 9w (n=4); hMLO 13w, hCO 7w and 27w (n=3)].

본 연구는 전분화능 줄기세포를 이용하여 3차원적 분화 배양을 통해 midbrain development 과정을 구현하고, 도파민 뉴런들이 밀집되어 있는 midbrain-like organoid를 최초로 보고한 사례입니다. 특히 PD의 발병과 관련된midbrain의 substantia nigra pars compacta에 존재하는 A9 subtype 도파민 뉴런을 생산하였으며, 인간 및 유인원의 substantia nigra pars compacta에 높은 농도로 발견되는 A9 도파민 뉴런의 hallmark인 neuromelanin의 생산을 발견함으로써 in vitro 분화 배양을 통해 실질적 midbrain tissue에 매우 유사한 organoid를 만들었다는데에 의의가 있습니다. 이 organoid는 파킨슨 병을 연구할 수 있는 모델로서 신경세포의 문제, 의약품 테스트 등 다양한 연구를 진행할 수 있을것으로 생각합니다.

본 연구를 주도한 조중현 박사는 차의과학대학교 이동율 교수님 연구실에서 iPSC reprogramming연구를 진행하여 박사학위를 받았고, 이후 2014년부터 포스닥으로 Genome Institute of Singapore (GIS)의 Dr. Ng Huck-Hui 연구실에서 전분화능 줄기세포를 이용한 파킨슨병 모델링에 관련된 연구하고 있습니다. Dr. Ng Huck-Hui의 연구실은 현재 high-throughput screening 기술을 통해 pluripotency에 관여하는 새로운 factor를 찾는 연구를 진행해왔으며, 현재 organoid 기반 새로운 질병 메커니즘 및 치료제를 찾는 등의 분야로 연구 영역을 넓히고 있습니다. GIS는 Singapore정부 연구기관인 Agency for Science, Technology and Research (A*Star) 내의 Biomedical Research Council 내에서 genomics technology를 기반으로 cancer biology, stem cell biology, cellular pharmacology, 및 infectious diseases 등 인간 질병 연구를 진행하는 연구 기관입니다.