해외 연구 동향 2014년 6월

1. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.

Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen TS, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F.
Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7.

최근에 개발된 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 시스템은 특정 genomic loci의 gene의 mutation을 매우 간단하게 유도할 수 있으므로, genome-wide scale로 수 많은 gene들의 기능을 연구할 수 있는 tool로 이용이 가능하리라고 여겨졌음. 본 논문의 저자들은 guide sequence와 Cas9을 동시에 발현하는 Lentiviral vector를 이용하여 genome-wide scale CRIPSR-Cas9 knockout library(GeCKO)를 구축하였음. 18,080개의 유전자에 대한 64,751개의 guide sequences를 제작하여 GeCKO library를 제작한 후에 proof of concept 의 개념으로 human cancer cell과 pluripotent stem cell을 이용하여 negative and positive selection screening을 수행하였음. Cell viability에 필수적인 gene이 mutation 되었을 경우 cell이 죽는다는 생각으로 14일간 screening을 수행하고 lentiviral vector가 infection 된 cell을 harvest 하여 deep sequencing을 수행한 결과 ribosomal 구조 단백질등과 같은 cell viability에 관련된 sgRNA sequence가 사라지는 현상을 발견하였음. 이는 이 방법이 cell viability에 관련된 gene들을 genome-wide scale로 screening이 가능함을 보여주고 있음. Positive selection 방법을 검증하기 위해 vemurafenib(PLX)를 처리하면 죽는 A375 cell에 GeCKO library를 infection 시켜 PLX 저항성을 갖는 cell을 harvest 한 후 deep sequencing을 수행한 결과 neurofibromin 2 (NF2) 등의 sgRNA가 enrich 되어 있음을 확인하였음. 이는 본 방법이 특정 약물의 저항성을 갖게 하는 유전자들 genome-wide scale로 다량 발굴이 가능함을 시사함. NF2를 targeting 하는 lentiCRSPR 또는 shRNA vector를 제작하여 PLX에 대한 저항성을 비교해본 결과 lentiCRSPR system이 shRNA knockdown system 보다 훨씬 효율이 높음을 발견함으로써 본 연구에서 개발한 방법의 효용성을 입증하였음.

2. Lung stem cell differentiation in mice directed by endothelial cells via a BMP4-
NFATc1-thrombospondin-1 axis.

Lee JH, Bhang DH, Beede A, Huang TL, Stripp BR, Bloch KD, Wagers AJ, Tseng YH, Ryeom S, Kim CF.
Cell. 2014 Jan 30;156(3):440-55.

Lung stem cell은 stem cell의 주변의 microenviroment에서 분비되는 지금까지 밝혀지지 않은 인자에 의해 분화의 방향성이 결정됨. 본 논문의 저자들은 endothelial cells 와 brochioalveolar stem cells (BASCs)와의 3D coculture 실험을 통하여 Lung stem cell의 분화를 조절하는 인자 및 신호전달 체계를 규명하고자 하였음. BASCs는 lung endothelial cell과의 coculture를 하면 bronchiolar 와 alveolar 로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있음. 본 연구에서 gain (특정 gene의 overexpression 또는 knockout gene의 rescue 실험 등)- 또는 loss-of function (Knock out mice 에서 분리된 cell 이용) 실험을 수행하였음. Lung endothelial cell에서 BMP4-Bmpr1신호전달에 의해 세포 내 calcium의 level이 증가하고 이에 따라 protein phosphatase인 calcineurin의 활성이 증가하여 NFATc1 (Nuclear factor of activated T cell c1)의 dephosphorylation 및 nuclear localization이 유도되어 thrombospondin-1 (Tsp1)의 발현되는 것이 BASCs가 alveolar 로 분화하는데 필수적임을 밝혔음. Tsp1 null mice가 alveolar injury 후 repair가 잘 되지 않는 것으로 미루어 lung epithelial 세포의 분화와 재생에 있어서 BMP4-NFATc1-TSP1 신호가 중요함을 규명하였음. 본 연구에서 규명한 pathway는 multipotent stem cell로 부터 특정 epithelial lineage로 분화를 유도할 수 있는 방법을 제시한다고 할 수 있음. 또한 본 결과는 lung disease 또는 respiratory diseases의 치료를 위한 새로운 therapeutic target을 제공하는 중요성이 있음.

3. Premature termination of reprogramming in vivo leads to cancer development
through altered epigenetic regulation.

Ohnishi K, Semi K, Yamamoto T, Shimizu M, Tanaka A, Mitsunaga K, Okita K, Osafune K, Arioka Y, Maeda T, Soejima H, Moriwaki H,
Yamanaka S, Woltjen K, Yamada Y.
Cell. 2014 Feb 13;156(4):663-77.

일반적으로 암은 genetic mutation의 축적에 의해 유발이 된다고 생각되어 왔음. 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)이 만들어지는 과정에서는 genomic sequence 자체의 변화는 일어나지 않지만, iPSCs는 암세포의 특성인 무제한적인 성장 능력을 획득하게 됨. 본 논문의 저자들은 reprogramming factor (Yamanaka factor)를 in vivo에서 doxycycline (Dox)의 처리에 의해 조절할 수 있는 mice model system을 이용하여 실험을 수행하였음. In vivo에서 한시적으로 reprogramming factor를 발현시킬 경우 다양한 tissue에서 미분화된 dysplastic cell을 포함하는 종양이 형성되고, 이 cell 들에서는 DNA methylation의 global 한 변화가 일어남을 발견하였음. Dox를 7일간 처리 한 후 Dox를 제거한 후 7일 후에 Kidney에서 유발되는 종양은 소아 신장암 (pediatric kidney cancer)로 알려진 Wilms tumor와 유사한 특성을 갖고 있음을 발견하였음. 또한 Dox 제거 후 형성된 kidney tumor cell에서 유도된 iPSCs가 nonneoplastic kidney cell을 형성함을 발견하였는데, 이는 tumor의 형성과정에서 비가역적인 genetic transformation이 일어나지 않았음을 시사함. 본 연구 결과는 iPSC의 유도과정에서 일어나는 epigenetic 조절이 특정 형태의 암의 발생과정에서도 일어날 가능성을 시사하고있음.

4. Nuclear reprogramming by interphase cytoplasm of two-cell mouse embryos.

Kang E, Wu G, Ma H, Li Y, Tippner-Hedges R, Tachibana M, Sparman M, Wolf DP, Sch?ler HR, Mitalipov S.
Nature. 2014 May 1;509(7498):101-4.

Metaphase II에 멈춰있는 미수정란의 핵을 체세포(somatic cell)의 핵으로 치환(SCNT)하여 성공적으로 포유류의 클로닝이 성공적으로 수행된 사실은 난자의 cytoplasm에 체세포의 핵을 전능한(totipotent) 세포로 reprogramming 할 수 있는 인자가 존재하리라는 것을 시사함. 수정이 일어난 난자의 세포질은 체세포의 핵을 reprogramming 할 수 있는 능력이 현저하게 떨어지므로 아직까지 밝혀지지 않은 인자들의 level은 수정 후 급격히 감소되리라고 가정 할 수 있음. 또한 최근에 metaphase로 유지하면 이배수체의 세포질도 SCNT 에 의한 배아줄기세포(ESCs)의 유도 효율을 높일 수 있다고 보고된 바 있음. 이러한 일련의 결과들은 난자의 세포질에 결정적인 reprogramming 인자들이 존재하고, 이 인자들은 interphase 시기에는 핵내에 존재하여서 난자의 핵을 치환하는 과정에서 제거 되리라는 가설에 도달하게 하였음. 본 논문의 저자들은 우선 two-cell mouse embryo의 세포질(I2C)에 reprogramming activity가 존재함을 검증하였음. 첫째로 후보 reprogramming 인자들이 난자, interphase 또는 metaphase에 핵이 제거된 난자 및 two-cell embryo에 존재하는지 여부를 확인 하였음. 분석결과 핵을 제거하는 과정에서 결정적인 인자의 제거가 수반되리라는 가능성은 배제되었음. 두 번째로 저자들은 공여자(ES cell, fetal fibroblast cell 및 완전히 분화된 Cumulus cell)과 수여자 I2C 의 cell cycle stage를 동일화(synchronize)시킨 후 SCNT 배아를 배반포(blastocysts)로 발생시키고 전형적인 germline transmission 및 tetraploid chimaeras의 형성여부를 검증하였음. 이 실험 결과 I2C의 세포질이 효율적인 reprogramming을 유도할 수 있으며, 공여자와 수여자 세포간의 cell cycle synchronization이 가장 중요한 parameter임을 밝혔음. Interphase의 세포질의 사용이 SCNT의 효율을 증대시킬 수 있다는 사실은 MII 기에 멈추어 있는 미수정란을 확보하는 것이 현실적으로 매우 어려운 상황임을 고려할 때, 세포 치료 목적으로 SCNT후 만들어지는autologous human ES cell을 사용할 수 있는 가능성을 확장시키는 중요성이 있다고 할 수 있음.

5. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid
pluripotent stem cells.

Yamada M, Johannesson B, Sagi I, Burnett LC, Kort DH, Prosser RW, Paull D, Nestor MW, Freeby M, Greenberg E, Goland RS, Leibel RL, Solomon SL,
Benvenisty N, Sauer MV, Egli D.
Nature. 2014 Apr 28. doi: 10.1038/nature13287. [Epub ahead of print]

난자의 핵을 체(somatic)세포의 핵으로 치환할 경우 배아 줄기세포(Embryonic Stem cels, ESCs)와 상응하는 만능(pluripotent) 줄기세포가 형성될 수 있어서 자가 세포 치료(autologous cell replacement therapy)의 가능성이 제시되어 왔음. 체세포에 몇 가지 전사인자를 발현시켜서 유도 만능줄기세포(iPSCs)를 만드는 기초 연구들이 활발하게 수행되고 있기는 하지만, iPSCs와 ESCs 간에는 여러 가지 상이점이 존재함이 밝혀져서 실제로 임상에 iPSCs를 적용하기에는 어려움이 있음. 성인 환자 세포에서 유도된 배아줄기세포가 세포치료에 있어서의 이용 가능성이 매우 높으므로 본 논문의 저자들은 배반포(blastocysts)의 발생 및 줄기세포의 제작에 관여하는 인자들을 체계적으로 조사하고자 하였음. Kinase와 단백질 합성을 억제하는 small molecule 및 histone deacetylase inhibitor의 조합에 의해 난자의 활성 및 핵 치환 후 배반포로 발생하는 효율을 증대시키는 방법을 개발하였음. 발생 효율은 공여된 난자에 따라 변하는데 난자의 성숙을 위해 처리한 hormone의 처리시간과는 반대의 상관관계가 있지만 하루에 투여하는 gonadotropin의 양이나 metaphase II 단계에 멈춰있는 난자의 수와는 무관함을 밝혔음. 농축된 Sendai virus를 이용하여 세포 융합(cell fusion)을 유도할 경우 세포 내 Calcium의 농도가 높아지고 조기 난자의 활성(premature oocyte activation)이 일어나므로 Calcium이 없는 배지에서 희석된 Sendai virus를 이용하였음. 이와 같이 약간 수정된 핵치환 방법을 이용하여 세계 최초로 Type I 당뇨병을 지닌 태아 및 여성 환자의 somatic 세포로부터 정상적인 이배수체의 만능줄기세포주를 구축할 수 있었음.

참고로 아래 Retraction Notice에서 보는 바와 같이 2011년 8월에 Cell지 (Cell14, 35-371)에 발표되었던 AD 환자의 skin fibroblast를 functional neuron으로 direct conversion 시키는 논문은 재현성 및 부적절한 이미지의 조작의 이유로 금년 4월에 철회되었음.

Retraction Notice to: Directed Conversion of Alzheimer’s Disease Patient Skin Fibroblasts into Functional Neurons Liang Qiang, Ryousuke Fujita, Toru Yamashita, Sergio Angulo, Herve Rhinn, David Rhee, Claudia Doege, Lily Chau, and others Cell 2014 April 10 Vol. 157, Issue 2, p514